근래에 들어 항바이러스제인 핵산 유사체들이 도입된 후부터 B형간염 치료는 획기적인 발전을 이루어 왔다. 그러나 이러한  장기간 사용하였을 때에 나타날 수 있는 바이러스 돌연변이와 이에 따르는 약제 내성 발생은 역전사 과정을 거치는 HBV 증식의 특성을 고려해 볼 때 이미 예견되었던 일들이다. 여기에서는 현재 사용되고 있는 몇몇 핵산유사체의 효능과 장기간 사용했을 때에 나타나는 내성 발생의 현황 그리고 이에 관련된 바이러스 유전자의 변이에 관하여 알아본다.

 건국대학교병원  소화기내과 권소영 교수

새로운 핵산 유사체

B형간염바이러스(HBV)는 DNA바이러스로 숙주의 세포 내에서 cccDNA transcri-ptional template의 형태로 존재하며, 바이러스의 증식 과정에서 pregenomic RNA의 역전사 과정을 거치는 특징을 가지고 있다.

일반적으로 HBV유전자의 변이 빈도는 1.4~3.2x10-5/site/yr. 로 다른 DNA바이러스에 비해 10배 정도 높은 빈도를 보인다.

이러한 현상은 세포의 polymerase와는 달리 HBV polymerase(HBV pol)는 역전사효소(reverse transcriptase)의 기능을 하기 때문에 proofreading의 기능이 없어서 잘못 들어온 뉴클레오타이드를 교정할 수 없기 때문에 발생한다.

만성 HBV보유자에서 HBV유전자의 다양한 부위에서 발생하는 변이는 환자의 임상 경과에 영향을 미쳐서 면역관용기와 면역제거기를 결정하는 데 중요한 요인으로 작용할 수 있다.

또한 다른 질병 때문에 또는 이식 후에 면역억제제를 투여 받는 동안에 간염을 악화시키는 요인이 되기도 한다.

HBV는 하루에 1011 virion이상을 생성할 수 있는 높은 증식력을 보이기 때문에 증식 과정 중에 많은 변이들이 출현한다.

그러나 HBV유전자는 구조적으로 다양한 ORF(open reading frame)들이 서로 겹쳐 있기 때문에 변이종들이 HBV의 증식과 생존에 영향을 미칠 수 있기 때문에 자연적인 조건에서는 변이종들이 우세해질 수 없다.

그러나 자연적으로 빈번하게 발생하는 HBV변이종들은 혼재되어 있다가 항바이러스제 투여 후에 바이러스 증식이 억제되면서 약제에 내성을 보이는 일부 변이종들이 선택적으로 증식할 수 있다.

약물의 항바이러스 작용이 매우 강해서 투여 후 단 기간 내에 바이러스 증식을 억제시켜서 바이러스 증식이 거의 일어나지 않는다고 가정하면 약제 내성 변이 또한 발생하지 않을 것이다 (“no replication, no resistance”).

내성의 정의와 내성 변이의 검출 방법

B형간염 환자에서 항바이러스제 투여 후에 바이러스가 음전되고 지속적으로 약제를 복용하던 중에 혈중 바이러스 농도가 통상적인 HBV DNA검사 방법의 검출 한계치 이상으로 양전되는 것을 바이러스 돌파(viral breakthrough), 즉 내성이라고 한다.

바이러스의 내성(resistance)이 발생하기 전에 이미 치료 전에는 없었던 HBV pol부위의 유전자 변이가 나타나는데 이러한 현상을 유전자형 내성 (genotypic resistance)이라 한다.

유전자형 변이를 알아내기 위한 방법들은 여러 가지가 있다 [표1].

[표1] HBV 악제 내성 유전자변이의 검사 방법 비교
 

과거에는 실험실에서 바이러스 변이를 검출하기 위해서 특정 부위의 유전자를 증폭시켜서 염기서열을 분석하는 방법을 이용했으나 이러한 sequencing방법은 변이종이 전체의 30%이상을 차지해야만 검출되는 문제점이 있어서 HBV pol의 변이를 조기에 감지하기 어렵다.

그러나 direct sequencing 방법은 특정 부위 유전자의 다양한 변이들을 찾아낼 수 있기 때문에 새로운 변이를 찾아내기 위해서 반드시 필요한 방법이다.

HBV pol의 약제 내성 변이를 검출하기 위해서 현재 가장 많이 사용하는 방법들로는LiPA(line probe assay), RFLP (restriction fragment length polymorphism), RFMP (restriction fragment mass polymorphism)가 있다. RFMP는 제한효소로 절단된 DNA분절 부위의 분자 질량을 측정하는 방법으로 소량의 변이를 알아낼 수 있는 매우 예민한 검사법이다.

또한 변이종과 wild type바이러스의상대적인 양적 분석이 가능하고 고가의 장비를 사용하기는 하나 빠른 시간 내에 검사할 수 있다는 장점이 있어서 최근 우리나라에서 상용화되어 쓰이고 있다.

다양한 B형 간염 치료제들이 개발되면 이에 따르는 다양한 부위의 내성 변이들도 필연적으로 발생할 것으로 예측된다.

유전자 변이를 조기에 감지하고 임상에 응용하기 위해서는 검출 방법의 개발과 체계적인 적용이 중요하다.

라미부딘 내성  투여 3년 후 50% 보여

라미부딘(Lamivudine, 3TC)은  현재 가장 널리 사용되고 있는 B형간염 치료제로서 장기간의 치료 경험과 내성 발생에 대한 지식이 추적되어 있는 핵산유사체이다.

라미부딘 투여 후 1년에 14~30%, 2년에 35~40%, 3년에 50%이상의 내성 빈도를 보이는 것으로 알려져 있으며, 국내에서도 이와 비슷한 내성 발생 빈도가 보고 되었다 [그림1].

[그림1] 라미부딘과 아데포비어 투여 중 내성변이 발생 빈도
 

라미부딘 치료 중 발생한 내성 변이는 선택적으로 증식하게 되어 wild type HBV를 대치하며, 더욱 증식하여 일정한 수에 도달하면 혈청에서 통상적인 HBV DNA검사법으로 검출되는 바이러스 돌파현상을 (viral breakthrough) 나타낸다.

바이러스 돌파 현상이 발생하면 대부분의 환자에서 ALT 상승과 함께 간염이 악화되지만 wild type바이러스에 의한 간염에 비해서 ALT치 상승 정도가 약하고, 바이러스는 검출되지만 e항원 양성 예에서 e항원이 음전 되거나 또는 e항원 음전 상태가 유지되기도 한다.

그렇지만 일부 환자에서는 간염이 심하게 악화되어 급격한 간기능 부전을 보이는 경우도 있다.

라미부딘 내성 HBV는 세포주를 이용한 실험에서 wild type에 비하여 바이러스 polymerase 활성도가 적고 virion 생성도 감소한다. 그러나 라미부딘 내성변이와 함께 precore나 basal core promotor부위의 변이를 가진 바이러스에서는 오히려 wild type보다 바이러스 증식 정도가 증가하는 경향을 보인다.

따라서 precore변이를 가진 환자들에서는 라미부딘보다 아데포비어를 사용하거나 병용치료 하는 것을 고려해 볼 수 있겠다. 

YMDD변이형은 wild type에 비하여 증식 능력이 약하기 때문에 라미부딘을 중단하면 곧 wild type으로 대치된다. 따라서 라미부딘 내성 발생 후에 약제를 중단하게되면 wild type바이러스에 의한 간염을 유발할 수 있다.

아데포비어는 라미부딘 내성 바이러스에서 효과적으로 작용하므로 라미부딘 내성을 보이는 환자에서는 아데포비어로 대치하거나 라미부딘과 병용투여 해볼 수 있다.

라미부딘 내성 환자에서 아데포비어 단독치료와 라미부딘과의 병용치료는 동등한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

그러나 라미부딘을 중단하면 wild type에 의한 간염 악화의 가능성이 있고 실제 아데포비어 단독 투여 시에 첫 3개월 동안 ALT상승을 보이는 예들이 많아서, 심한 간기능 악화가 우려되는 환자에서는 내성 발생 후 아데포비어로 치환하는 기간의 2~3개월 동안 라미부딘을 병용 투여하는 것이 안전하다.

라미부딘 내성은 특히 치료 전 바이러스 양이 많거나 ALT치가 높고 약제 투여 후에 바이러스 감소 효과가 적은 경우에 잘 발생한다 [표2].

[표2]  라미부딘 내성 발생의 위험인자
 

이전에 라미부딘을 투여 받은 적이 있는 환자에서 초치료 예들에서 보다 내성 발생의 빈도가 높은 것으로 알려져 있다. 

간경변 환자를 대상으로 한 연구에서도 50% 정도의 내성 변이를 보이는 것으로 보고됐으며 내성 변이를 보인 환자들은 Child-Pugh점수가 증가하고 간기능이 악화되는 빈도가 높아서, 간경변 환자에서 라미부딘을 투여할 때에는 대상성 간질환 환자라 하더라도 내성 변이의 출현과 바이러스 돌파 현상에 관한 세심한 모니터링과 조기 진단이 중요하다. 

라미부딘 내성에 관여하는 유전자 변이는 크게 네 가지 유형으로 나누어 볼 수 있는데 HBV DNA pol C domain의 rtM204I/V (YMDD mutant)가 대표적이다.

이 밖에도 rtL180M+ rtM204V, rtL108M+ rtM204I, rtM173L+rtL180M+ rtM204IV의 다양한 변이형들이 있다 [그림2]. 

[그림2] HBV Pol Resistance Mutations
 

라미부딘 투여 후에 변이 발생을 관찰해 보면 rtM204I, rtL108M+ rtM204I, rtL108M+ rtM204V의 순서로 출현하는 양상이 가장 흔하다.

YMDD변이형 HBV는 라미부딘에 대한 약제 감수성이 100배 이상으로 감소하기 때문에 라미부딘을 계속 투여하여도 더 이상 바이러스 억제 효과를 기대하기 어렵다.

YMDD변이에 의한 라미부딘 내성의 기전은 dNTP결합 부위에서 valine이나 isoleucine아미노산의 beta-branched side group에 의해서 입체 구조적으로 방해 (steric hinderance)를 받기 때문이다.

아데포비어는 이 결합부위의 영향을 받지 않기 때문에 YMDD 변이형에 효과적으로 작용한다.

반면에 Clevudine, Telbivudine과 같은 L-nucleoside들은 라미부딘과 교차내성을 보인다 [표3].

[표3] B형간염 항바이러스제 교차내성
 

YMDD 변이형은  라미부딘 치료를 전혀 받지 않은 환자에서도 5%내외의 빈도로  관찰된다. YMDD 변이형을 가진 환자에서 라미부딘을 투여하면 바이러스가 감소하면서 검출되지 않거나 또는 라미부딘 내성을 일으켜서 간기능이 악화되기도 하는 다양한 경과를 보인다.

아데포비어 내성 4년 후 18%

아데포비어는 라미부딘 내성 바이러스에 효과적으로 작용하며, 만성 B형 간염의 1차 약제로도 매우 효과적이다.

아데포비어(Adefovir dipivoxil) 에 투여 후 내성 발생 빈도는 라미부딘에 비하여 매우 낮아서 2년에 2%, 3년에 4%, 4년후에 18% 정도이다 .

Hadziyannis등이 최근에 e항원 음성 환자를 대상으로 한 연구에서도 2년에 3%, 3년에 6%로  비슷한 내성 빈도를 보고하였다[그림1]. 

대부분의 내성 발생 환자들에서 바이러스의 돌파 현상과 함께 ALT치의 상승을 동반한다.

최근 서구에서는 라미부딘의 높은 내성 발생율로 인해서 만성B형간염의 일차 치료로서 아데포비어를 선택하는 추세지만 우리나라에서는 라미부딘 내성 환자에서만 보험이 적용되므로 일차 치료로 사용하기에는 경제적인 부담이 크다.

우리나라의 아데포비어 치료 결과에서는 이보다 높은 내성 발생 빈도를 보이고 있어서 [그림3] 장기적인 추적 관찰을 통한 전향적 연구가 필요하다.

[그림3] 아데포비어 치료기간 중 HBV Pol. 유전자 변이의 누적 발생율
 

아데포비어 내성 유전자 변이는 HBV pol 의 B domain (rtA181T)과 D domain (rtN236T) 변이가 대표적이며, 이밖에도 rtV214A나 rtQ215S변이가 있다. rtN236T 변이는 라미부딘의 항바이러스 작용을 저해하지 않지만 rtA181T/V와 rtV214A, rtQ215A변이는 라미부딘과 일부 교차내성을 보이는 것으로 보고 되고 있다.

아데포비어는tenofovir와 작용부위의 그 구조가 비슷해서 일부교차내성을 보인다. 아데포비어 내성 변이에는 라미부딘, 엔테카비어 또는 emtricitabine이 효과적이다.

라미부딘 내성을 보이는 환자에서 아데포비어를 사용하는 경우들이 늘어나면서 라미부딘과 아데포비어 모두에 내성변이를 보이는 예들을 간혹 관찰할 수 있다.

이러한 환자들에서 현재 사용할 수 있는 약제가 한정되어 있기 때문에 약제를 선택함에 있어서 곤란을 겪기도 한다.

이러한 변이 바이러스는 세포주를 이용한 실험에서 인터페론이나 엔테카비어 또는 tenofovir에 약제 감수성을 보이는 것으로 보고된 바 있다.

Tenofovir는 항바이러스 작용이 강하고 라미부딘 내성 바이러스에 잘 듯고 아데포비어 내성 바이러스에서도 항바이러스 효과를 보이기 때문에 두약제 모두에 내성을 보이는 경우에 사용해 볼 만 하다.

그러나 tenofovir는 rtN236T 변이가 있는 경우에 다소 항바이러스 효과가 떨어지므로 다른 항바이러스제 또는 페그인터페론과 병용 투여 하는 방법을 고려해볼 수 있다.  

엔테카비어는  라미부딘 내성 환자에서 변이 보여

엔테카비어(Entecavir)는 강력한 항바이러스 작용을 나타내며 초치료 환자에서 아직까지 내성 발생 예는 없다.

그러나 라미부딘 내성 환자에게 48주동안 투여했을 때에 내성 변이 발생 빈도가 6%였고 1%에서는 바이러스 돌파 현상을 보이는 것으로 보고 된 바 있다.

엔테카비어 내성 유전자 변이의 부위는 HBV pol B domain의 rtS184G와 rtS202I, rtM250V 로 다양한 부위에서 발현된다 [그림2]. rtM250V변이는 엔테테카비어의 항바이러스 작용을 9배 정도 감소시키는 것으로 알려져 있는데, 그 기전은DNA primer와 DNA template간의 결합 작용을 방해하기 때문이다.

이러한 유전자 변이를 보이는 환자들의 일부에서만 HBV DNA의 증가와 ALT상승을 동반하는 내성 소견을 보이기 때문에 현재로서 유전자 변이의 임상적 의의는 불명확하다.

엔테카비어 내성 HBV는 아데포비어나 tenofovir에 의해서 증식이 억제되지만 라미부딘은 항바이러스 효과가 없는 것으로 알려져 있다.

내성변이의 예방과 대책

현재까지 밝혀진 HBV내성 변이와 임상적 변화와의 관련성에 관한 정보는 약물과 HBV 상호 작용을 알아내기에는 빙산의 일각에 불과하다. ‘no replication, no resistance’의 개념을 적용시켜볼 때에 아주 강력한 항바이러스가 등장하여 투여 후 단 기간 내에 바이러스를 일정 수준 이하로 억제시킬 수 있으면 가장 바람직할 것이다.

그러나 실제로 이렇게 강력한 항바이러스제는 아직 없기 때문에 현재로서 가장 이상적인 방법은 AIDS치료 경험에서와 마찬가지로 서로 다른 작용 기전을 가진 항바이러스제들을 병용 투여해서 단기간동안에 바이러스 증식을 최대한 억제시키는 것이 될 것이다. 

인터페론은 경구용 항바이러스제에 비해서 치료 반응률이 낮고 부작용이 많다는 단점이 있으나 치료 기간 중 내성 발생이 없고 치료 후 지속적인 반응을 보인다는 장점이 있다.

여러 항바이러스 약제에 내성을 보이거나 한 개의 약제에 내성을 보이더라도 인터페론 치료의 적절한 대상이 된다면 최근에 B형간염 치료에 사용되고 있는 페그인터페론을 투여해 보는 것도 좋은 대안이 될 것이다.

우리나라의 경우 과거에 인터페론 치료 성적이 서구에 비해서 크게 떨어진 점을 감안할 때 항바이러스제 내성 환자에서의 치료 결과에 대한 추시가 필요하다.

항바이러스제들을 초치료부터 병용할 것인지, 한 가지 약제에 내성을 보인 후에 다른 약제로 치환하거나 병용 투여 할 것인지에 대해서는 앞으로 실험적, 임상적 연구가 필요하다.

이러한 연구 결과를 토대로 어떠한 대상 환자들을 어떠한 방법으로 치료를 해야 치료 반응을 극대화하고 내성 발생을 최소화 할 수 있을지를 결정할 수 있을 것이며 경제적인 측면 또한 검토되어야 할 것이다. 

간기능의 예비능력이 떨어져 있는 환자에서 약제 내성이 발생하는 경우에는  심한 간기능 부전을 초래할 수 있다.

핵산유사체를 간염 환자 뿐만 아니라 간경변 환자에서도 널리 사용하고 있는 현 시점에서 약제 내성 변이에 대한 세심한 관심과 염려가 무엇보다도 중요하다.

라미부딘은 비교적 오랜 기간 동안 사용되어서 효능과 내성에 대한 임상 경험이 추적되어 있으나 현재 시판 중인 아데포비어나  엔테카비어에 대해서는 앞으로 많은 연구가 필요하다.

향후 tenofovir, telbivudine, clevudine, emtricitabine 등 수많은 항바이러스들이 도입되면 바야흐로 만성B형간염 치료의 춘추 전국시대를 이룰 전망이다. 

이에 따르는 여러 모습의 내성 바이러스의 출현 또한 예측되는 결과이다. 내성 변이를 조기에 알아낼 수 있는 진단 방법이나 분자 생물학적 연구의 발전하면서 바이러스의 다양한 내성 변이와 그 기능적 역할을 규명할 수 있기를 기대해 본다.